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生長激素釋放因子ELISA試劑盒
（美國DRG*，貨號：EIA3429 ）
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預期用途
此試劑盒基于競爭酶免法檢測特異性多肽和相關多肽。
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實驗原理美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
微孔板預包被有第二抗體，非特異性結合位點封閉，主要抗體的Fab片段競爭結合生物素標記的多肽和標準品或樣本中的目的多肽，二抗則與Fc片段結合。生物素標記的多肽與HRP-鏈霉親和素反應，催化底物反應，黃色強度直接與生物素標記多肽-HRP-鏈霉親和素復合物的量成正比，但是與標準品或樣本中的多肽量成反比。根據(jù)已知濃度建立標準曲線，樣本中未知濃度的多肽濃度可直接從標準曲線上讀取。
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試劑盒組成美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
 

1. 20X的緩沖濃縮液，50ml
2. 微孔板，96孔
3. 封板紙
4. 主要抗血清，兔抗多肽IgG，1支
5. 標準品，1支
6. 生物素標記多肽，1支
7. HRP-鏈霉親和素，30ul
8. 陽性質控，2支
9. 底物液，12ml
10. 終止液，2N鹽酸，15ml
11. 坐標紙
12. 說明書

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實驗所需材料但試劑盒未提供美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
 

1. 酶標儀（450nm）
2. 振蕩器，300-400rpm
3. 洗板系統(tǒng)
4. 多通道移液器，50-100ul
5. 溶液貯存瓶
6. 吸水紙
7. 采血管（可選）
8. 抑肽酶，0.6TIU/ml血液（可選）
9. 緩沖液A（可選）
10. 緩沖液B（可選）
11. C18分離柱

注意：打開試劑和試驗開始前先將其平衡至室溫（20-23℃），強烈建議稀釋過的溶液盡快使用，采血步驟見盒子內的采血說明書，每個盒子所含成分足夠用于96人份檢測或40人份的雙孔檢測。
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實驗步驟美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
 

1. 實驗前認真閱讀說明書，所有試劑平衡至室溫（大約25-45min）
2. 用950ml的去離子水稀釋20X的緩沖濃縮液，得到1X的試驗緩沖液，用于稀釋其他試劑和樣本。注意：如果20X的緩沖液出現(xiàn)了結晶，可在水浴鍋內加熱使其*溶解，使用前*混勻
3. 用1X的緩沖液稀釋，離心標準品，振蕩。Stock solution的濃度為1000ng/ml，室溫下放置至少10min，至*溶解。使用前離心，振蕩。美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。

標準品準備如下美國DRG中國*代理，。 美國DRG中國*代理，。
編號          標準品的量            緩沖液的量             濃度
Stock           1000ul                ----                    1000ng/ml
#1             100ul的Stock          900ul                  100 ng/ml
#2             100ul的#1             900ul                  10 ng/ml
#3             100ul的#2             900ul                  1ng/ml
#4             100ul的#3             900ul                  0.1 ng/ml
#5             100ul的#4             900ul                  0.01 ng/ml

 

1. 用5ml的1X的緩沖液稀釋主要抗體，放置至少5min，至*溶解，*混勻
2. 用5ml的1X的緩沖液稀釋生物素標記多肽，放置至少5min，至*溶解，*混勻
3. 200ul的1X緩沖液稀釋質控，放置至少5min，至*溶解，*混勻
4. 將A1和A2孔作為空白對照（Blank）
5. 在B1和B2孔內加50ul的1X緩沖液，作為Total Binding
6. 將配制好的標準品由#5到#1各50ul依次加入至C1和C2—G1和G2孔內，注意，標準品需做雙份檢測
7. H1和H2孔加入50ul已稀釋的陽性質控，注意，陽性質控也要做雙孔檢測
8. 將50ul樣本加入至相應孔內，做雙孔檢測
9. 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀釋的主要抗體
10. 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀釋的生物素標記多肽，注意，不建議生物素標記多肽或主要抗血清加樣時使用多通道移液器
11. 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育2小時
12. 在3000-5000rpm下將HRP-鏈霉親和素離心5秒，然后取12ulSA-HRP和12ul 1X的緩沖液混勻
13. 移取蓋板，倒去反應液
14. 每孔350ul 1X緩沖液洗板4次，吸水紙上拍干
15. 每孔加100ul的SA-HRP
16. 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育1小時
17. 移取蓋板
18. 同步驟17）
19. 每孔加100ul的TMB底物液
20. 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育1小時
21. 移取蓋板，每孔加100ul的2N 鹽酸終止反應。溶液顏色由藍色變黃色，如未出現(xiàn)統(tǒng)一的顏色變化，用手輕輕拍板，使其*混勻，20分鐘內進行下一步驟
22. 酶標儀450nm處讀數(shù)

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結果計算美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
在半對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線。標準品的濃度為X軸，相應的OD值為Y軸，用四參數(shù)或對數(shù)-對數(shù)法繪制zui合適的標準曲線。濃度與OD值成反比關系，隨著標準品濃度的增加，黃色強度就減少，即OD值減少
樣本濃度可直接從標準曲線上讀取。如果樣本實驗前進行了稀釋，則zui后結果應乘以相應的稀釋因子
標準曲線為逆向S型曲線美國DRG中國*代理，。 美國DRG中國*代理，。
 
附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數(shù)，如坐標參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結果。美國DRG中國*代理，。
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貯存美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
 

1. 收到貨后貯存于4℃
2. 強烈建議盡快使用配制的試劑
3. 1X緩沖液貯存于4℃
4. 將不用的微孔板放回至密封袋內密封起來，貯存于4℃
5. 已稀釋的標準品，生物標記物，抗體和HRP貯存于4℃

樣本采集的建議美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
血液采集美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
用含有EDTA的采血管采集血液，每管可裝7ml，采到了抗凝血液后立即搖晃幾次，將血液從采血管轉至含抑肽酶的離心管，不斷搖晃，抑制蛋白酶活性，1600xg轉速，4℃下離心15min，，收集血漿，血漿樣本可在-70℃下保存1個月。如果采血管可用于離心，可直接將抑肽酶加入至采血管內。美國DRG中國*代理，。
血漿中提取多肽美國DRG中國*代理，。美國DRG中國*代理，。
 

1. 用等量的緩沖液A酸化血漿，如1ml的血漿加入1ml的緩沖液A，混勻，6000-17000xg下，4℃離心20min
2. 分離柱內含200mg的C18，依次用緩沖液A（3ml ，3次）和緩沖液B（1ml，1次），使其平衡

注意：步驟3-5中不能對分離柱施加任何壓力
 

1. 將酸化的血漿倒入至預平衡的C18分離柱內
2. 用緩沖液A（3ml，2次）慢慢洗柱，倒去洗液
3. 用緩沖液B（3ml，1次）慢慢洗提多肽，收集至塑料管內
4. 用離心濃縮機或其他方法將洗提液蒸干
5. 將抽提物直接貯存于-20℃，并盡快進行試驗，用1X的緩沖液直接配制。如果多肽濃度不在檢測范圍內，就直接進行稀釋或濃縮

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