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內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒

內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒

日本IBL*，貨號：27165

日本IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

1、前言說明

內(nèi)皮素-1（一種21個氨基酸分子組成的多肽）是目前所知的zui有效的血管收縮劑。1985年Rubanyi研究小組發(fā)現(xiàn)了一種多肽并將其命名為內(nèi)皮源性收縮因子（EDCF），之后Yanagisawa將其分離、測序、克隆，并命名為內(nèi)皮素，而且認為它是zui有效的血管收縮劑，這使得人們了解到它更多的生理功能。內(nèi)皮素-1（ET-1）是哺乳動物三種血管活性肽家族中的一種，這三種血管活性肽還包括內(nèi)皮素-2和內(nèi)皮素-3。這兩種相關(guān)多肽的2和6號位的氨基酸與ET-1的不同。這些基因可以產(chǎn)生三種前肽，之后可分解成三個含39個氨基酸分子的內(nèi)皮素分子。我們可以獲得一系列內(nèi)皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物學知識。ET-1對平滑肌細胞、成纖維細胞有強烈效應(yīng)，并且它也參與很多疾病過程，特別是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、腎衰竭和肺動脈高血壓中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、豬、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。

2、日本IBL*，內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒實驗原理

此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，整個試劑盒使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強度與樣品中ET-1的量成正比。測量范圍：0.78～100pg/ml

3、日本IBL*，內(nèi)皮素-1 ELISA試劑盒應(yīng)用范圍

IBL的ET-1 ELISA試劑盒可用于人血清、EDTA血漿、細胞培養(yǎng)液上清和組織提取液中ET-1的定量檢測。

4、日本IBL*，試劑盒成分

1）包被板：微孔用抗ET^15-21兔IgG包被，96孔。

2）濃縮型酶標抗體：HRP標記的抗ET-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml。

3）標準品：ET-1，0.5ml×2。

4） EIA緩沖液：內(nèi)含1%的BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，30ml。

5）用于稀釋酶標抗體的稀釋液：內(nèi)含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml。

6）顯色劑：TMB底物液，15ml。

7）終止液：1N的H2SO4，12ml。

8）濃縮洗滌液：內(nèi)含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。

5、日本IBL*，操作指南

A、實驗所需器材但試劑盒不提供

1）酶標儀（450nm）

2）微量移液器和取樣吸頭

3）帶刻度的量筒與燒杯

4）蒸餾水

5）溫育器（37℃±1℃）

6）冷床箱（4℃）

7）坐標紙（log/log）

8）吸水紙

9）用于稀釋標準品的試管

10）洗滌瓶

11）酶標抗體稀釋的一次性試管

12）提取用的Sep-Pak C-18柱和試劑，見“樣品處理應(yīng)注意的問題”

B、試劑準備

1）洗滌液的準備：洗滌液是一種40倍濃縮的緩沖液，使用前應(yīng)當將洗滌液平衡至室溫，并混合均勻。用1950ml蒸餾水稀釋50ml濃縮洗滌液，混合均勻，這就是即用型的洗滌液。稀釋后的洗滌液應(yīng)當儲存于冰箱中至2周

2）酶標抗體的準備：標記抗體是30倍濃縮的，根據(jù)實驗所需要的量，用酶標抗體稀釋液將濃縮酶標抗體稀釋30倍，稀釋后就可以用了。例如：如果您檢測8孔，則需要800ul即用型的酶標抗體（用870ul酶標抗體稀釋液稀釋30ul濃縮的酶標抗體，并混合均勻，使用時每孔加100ul）。酶標抗體應(yīng)當在使用前臨時將其準備好。剩余的濃縮酶標抗體應(yīng)當密封儲存于4℃的環(huán)境下。

3）標準品的準備：在試管內(nèi)，用0.5ml蒸餾水稀釋標準品，并混合均勻，稀釋后ET-1標準品的濃度為200pg/ml。

4）標準品的稀釋：為標準品稀釋準備9個試管，在每個試管中加入230ul EIA緩沖液。每支試管的具體濃度如下：

試管1	100pg/ml
試管2	50pg/ml
試管3	25pg/ml
試管4	12.5pg/ml
試管5	6.25pg/ml
試管6	3.31pg/ml
試管7	1.56pg/ml
試管8	0.78pg/ml
試管9	0pg/ml（檢測樣品對照孔）

將230ul標準品溶液加入到試管1中，混合均勻；之后將230ul試管1中的溶液加入到試管2中，將標準品連續(xù)兩倍稀釋來確定8點標準品（濃度為100pg/ml到0.78pg/ml），EIA緩沖是檢測樣品空白對照，濃度為0pg/ml。

如圖：

5）檢測樣品的稀釋：如果有必要稀釋的話，用EIA緩沖液稀釋檢測樣品。如果您要用血清、血漿或組織樣做樣品，有必要用Sep-Pak C-18提取柱進行預(yù)提取。（見 “樣品處理應(yīng)注意的問題”）

7、日本IBL*，實驗步驟

在實驗開始大約30分鐘時，將所有的試劑都平衡至室溫。輕輕的并充分混勻試劑。確保所有試劑都未變質(zhì)。標準曲線的準備應(yīng)當與樣品的檢測同時進行。

試劑	檢測樣品	標準品	檢測樣品對照孔	試劑對照孔
試劑	檢測樣品100ul	稀釋標準品（1-8管）100ul	EIA緩沖液（第9管） 100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，4℃下溫育一整夜
洗板7次
酶標抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，37℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值