CA72-4 ELISA試劑盒說(shuō)明書
（德國(guó)DRG進(jìn)口原裝：EIA5071）
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1、簡(jiǎn)介
DRG CA72-4 ELISA試劑提供的材料用于在人體血清或血漿中定量檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原CA72-4 （TAG-72）。本實(shí)驗(yàn)僅供體外診斷使用。
CA72-4（癌抗原72-4）zui初被描述為由B72.3識(shí)別的抗原因子。B72.3是由相應(yīng)的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移后的膜萃取物免疫雜交生產(chǎn)的鼠單克 隆抗體。CA72-4被證實(shí)是1MDa的粘液樣糖蛋白，合成物稱為TAG72（腫瘤相關(guān)抗原72）。TAG72蛋白的分子量為48KD. 血清和血漿中的CA72-4的水平升高見(jiàn)于某些惡性疾病，包括胰、胃、膽、結(jié)腸、乳腺、卵巢、子宮頸、子宮內(nèi)膜的腫瘤。它對(duì)胃腸道和卵巢的腫瘤有很高的診 斷學(xué)的敏感性。盡管在一些良性的疾病如風(fēng)濕病和卵巢囊腫也發(fā)現(xiàn)有CA72-4的升高，但是臨床研究表明，對(duì)于胃腸道和卵巢腫瘤，特異性診斷高達(dá)95％。 CA72-4的水平和腫瘤的大小及分級(jí)緊密關(guān)聯(lián)。CA72-4是胃腸道腫瘤的病人選擇治療學(xué)的監(jiān)測(cè)和隨后的護(hù)理的指標(biāo)。另外合適的指標(biāo)是CA199和 CEA，另外，CA72-4是卵巢腫瘤的病人選擇治療學(xué)的監(jiān)測(cè)和隨后的護(hù)理的可靠性指標(biāo)，尤其是對(duì)于CA125陰性的病人。
2、實(shí)驗(yàn)原理
DRG公司的CA72-4酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測(cè)孔包被有能結(jié)合CA72-4分子上*抗原位 點(diǎn)的單克隆小鼠抗體。一份含有內(nèi)源性CA72-4的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過(guò)氧化物酶的抗CA72-4抗血清。孵 育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。結(jié)合上的辣根過(guò)氧化物酶的總量與樣本中CA72-4的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強(qiáng)度與病人樣品中 CA72-4的濃度成正比。
3、試劑盒成分
1）微孔板：12x8孔，可拆，微孔中包被抗CA72-4 單克隆抗體。
2）標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品0-4）：5支 0.5ml，即用，濃度為0,3，20，50，100U/ml，內(nèi)含無(wú)水銀防腐劑。
3）質(zhì)控高&低：2支 凍干粉，0.5ml，見(jiàn)“試劑準(zhǔn)備”，質(zhì)控品的濃度及范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。內(nèi)含無(wú)水銀防腐劑。
4）樣品稀釋液：一支，3ml，即用，內(nèi)含無(wú)水銀防腐劑。
5）酶聯(lián)物：1支 14ml，標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的抗CA72-4抗體，內(nèi)含無(wú)水銀防腐劑。
6）TMB底物液：一支 14ml，即用。
7）終止液：0.5M的硫酸，一支 14ml，即用，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。
8）洗滌液（40X）：一支 30ml.
注意：用于樣品稀釋的樣品稀釋液應(yīng)視需要而定。
4、實(shí)驗(yàn)需要器材（但試劑盒不提供）
1） 酶標(biāo)儀（450±10nm）。
2） 移液器
3） 吸水紙
4） 蒸餾水
5） 計(jì)時(shí)器
6） 坐標(biāo)紙或是數(shù)據(jù)處理軟件
5、試劑的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性
未開啟的試劑在2-8℃下儲(chǔ)存，在保質(zhì)期內(nèi)保持其穩(wěn)定性。不要使用過(guò)期的試劑。所有開啟了的試劑都應(yīng)在2-8℃下儲(chǔ)存，微孔板需在2-8℃下儲(chǔ)存，一旦打開了微孔板的袋子，需小心地將其重新密封。
6、試劑的準(zhǔn)備：
在使用前將所有的試劑和所需的板條平衡至室溫。
質(zhì)控品：在凍干粉中加入0.5ml的蒸餾水使其復(fù)溶，并至少放置10min，在使用前充分搖勻。復(fù)溶后的質(zhì)控品需在-20℃下儲(chǔ)存。
洗滌液：在30ml濃縮的洗滌液中加入1170ml的蒸餾水，zui終洗滌液的容積為1200ml。稀釋后的洗滌液在室溫下兩星期內(nèi)保持穩(wěn)定。
7、樣品的采集與存儲(chǔ)
本實(shí)驗(yàn)可使用血清或血漿（使用EDTA或肝素抗凝）樣品，不要使用溶血﹑脂血﹑黃疸的樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實(shí)驗(yàn)。
7.1樣品采集
血清：靜脈采血，允許使用凝血，在室溫下用離心法分離血清。全血未*凝固前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人血液可能需要更長(zhǎng)的凝血時(shí)間。
血漿：將全血收集到含有抗凝劑的離心管內(nèi)，收集后馬上用離心法分離。
7.2樣品的儲(chǔ)存
樣品蓋好蓋子后，可在實(shí)驗(yàn)前2-8℃下儲(chǔ)存5天，要更長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，應(yīng)在-20℃下凍存。在開始實(shí)驗(yàn)前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品。
7.3樣品的稀釋
在zui初的實(shí)驗(yàn)中，要是樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品，則樣品應(yīng)用按實(shí)驗(yàn)步驟所描述的10倍或100
倍稀釋。在計(jì)算濃度時(shí)需乘以此稀釋系數(shù)。
例子：
a） 按1：10稀釋： 10ul的血清+90ul的樣品稀釋液（充分搖勻）。
b） 按1：100釋?。?0ul按a）稀釋的血清+90ul的樣品釋稀液（充分搖勻）
8、實(shí)驗(yàn)步驟
8.1總論
1）在使用前所有試劑和樣品均需平衡至室溫，所有試劑要充分混合但不要起泡。
2）一旦實(shí)驗(yàn)開始，所有步驟都必須進(jìn)行到底而不能中斷。
3）對(duì)每種試劑﹑標(biāo)準(zhǔn)品和樣品使用一次性的吸嘴，以避免交叉污染。
4）吸光率決定于溫育時(shí)間和溫度，在開始實(shí)驗(yàn)前，建議準(zhǔn)備好所有的試劑，將需要檢測(cè)的微孔板固定在板架上，這些步驟保證每次加液步驟所需時(shí)間相同而沒(méi)有中斷。
5）按照一般的規(guī)律，酶反應(yīng)時(shí)間與溫育時(shí)間和溫度成線性比例。
8.2操作步驟
每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)含有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線
1）將實(shí)驗(yàn)所需數(shù)目的板條固定在板架上。
2）用一次性吸嘴將20ul的標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品加入相應(yīng)的檢測(cè)孔中。
3）每孔加入100ul的酶聯(lián)物。
4）*混合十秒，在此步驟里，充分搖勻十分重要。
5）不用封板，在室溫下溫育120分鐘。
6）快速棄去檢測(cè)孔中的內(nèi)含物，每孔用400ul洗滌液洗板五次，在吸水紙上用力拍板以除去殘留的液體。注意：洗板步驟是否正確將直接影響到實(shí)驗(yàn)的靈敏度和性。
7）每孔加入100ul的底物液。
8）在室溫下溫育30分鐘。
9）每孔加入100ul的終止液終止反應(yīng)。
10） 在加終止液后十分鐘內(nèi)，室溫下，于450nm處讀取吸光率。
9、結(jié)果計(jì)算
1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光率。
2）以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標(biāo)準(zhǔn)品中獲得的平均吸光率和其相對(duì)應(yīng)的濃度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3）利用樣品的平均吸光率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其相應(yīng)的濃度值。
4）自動(dòng)方法：使用立方函數(shù)﹑四參數(shù)模式或雙對(duì)數(shù)的計(jì)算機(jī)程序可得到結(jié)果。
5）樣品的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的濃度則需進(jìn)一步稀釋。在計(jì)算樣品的濃度的時(shí)候，要乘以稀釋倍數(shù)。
下面是CA72-4 ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的典型例子。
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 吸光率（450nm） |
| 零標(biāo)準(zhǔn)品（0 U/ml） | 0.08 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品1（3U/ml） | 0.19 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品2（20 U/ml） | 0.59 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品3（50 U/ml） | 1.16 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品4（100 U/ml） | 2.02 |
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