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人環(huán)磷酸鳥苷（ELISA）酶聯(lián)免疫試驗說明書

人環(huán)磷酸鳥苷酶聯(lián)免疫試驗

（德國IBL CM581021）

預期用途

此酶免試劑盒用于細胞裂解液，組織，血漿和尿液中cGMP的定量檢測

實驗原理

此試劑盒采用的競爭酶免法，游離的cGMP和乙酰膽堿酯酶標記的cGMP共同競爭結(jié)合位點上一定量的cGMP特異性兔抗。由于標記的cGMP量不變，隨著游離的cGMP的不同，標記cGMP與兔抗結(jié)合，結(jié)合的量與孔內(nèi)游離的cGMP濃度成反比。兔抗-cGMP復合物再與預先包被在微孔板內(nèi)的鼠單抗抗兔IgG結(jié)合，洗板洗去未結(jié)合的復合物，然后加入底物顯色液，反應液有明顯的黃色并在412nm處有強吸光度值，顯色強度與結(jié)合的標記cGMP濃度成正比，而與游離的cGMP成反比。

試劑盒組成

編號	成分	96孔	480孔
481022	抗血清	1支	1支
481020	乙酰膽堿酯酶	1支	1支
481024	標準品	1支	1支
400060	緩沖濃縮液（10X）	2支/10ml	4支/10ml
400062	洗滌緩沖濃縮液（400X）	1支/5ml	1支/12.5ml
400035	吐溫20	1支/3ml	1支/3ml
400004	鼠抗兔IgG包被板	1塊	5塊
400012	蓋板	1塊	5塊
400050	Ellman’s試劑	3支/100dtn	6支/250dtn
400031	無水醋酸	1支/2.5ml	1支/12.5ml
400029	KOH	1支	1支
400040	示蹤染料	1支	1支
400042	抗血清染料	1支	1支

實驗所需材料但試劑盒未提供

1. 酶標儀 405-420nm

2. 可調(diào)節(jié)的移液管和可重復使用的吸量器

3. 超純水

4. 用于樣品準備的其它器材

儲存條件和穩(wěn)定性

此試劑盒需按要求儲存于-20℃,并在有效期內(nèi)使用,有效期見盒外

實驗前準備

緩沖液制備

所有緩沖液貯存在4℃至2個月

EIA緩沖液準備

將1支EIA緩沖液（編號:400060）加90 ml超純水進行稀釋.確保沖洗掉瓶內(nèi)鹽類沉淀物.

洗滌液準備

用2L的超純水稀釋5 ml400倍濃縮的洗滌液（96T試劑盒,編號:400062）,同時加入1 ml吐溫20（編號:400035）或者用5L的超純水稀釋12.5 ml400倍濃縮的洗滌液（400T試劑盒,編號:400062）, 同時加入2.5 ml吐溫20（編號:400035）

提示:由于吐溫20是粘性液體,所以不能用常規(guī)的移液管移液.需用位移移液管與注射器進行定量.

樣品準備

一般情況下，尿液和組織上清液可用緩沖液稀釋，然后直接加入微孔內(nèi)。血漿，血清，全血和組織勻漿和其他非均勻的基質(zhì)可能會含有感染實驗的雜質(zhì)，在進行大量樣品檢測時是先進行干擾檢查。進行干擾檢測試驗時，稀釋1到2個檢測樣品，每個樣品兩個不同的稀釋比例，如果在zui后的cGMP濃度計算中兩個不同稀釋比例的樣品具有良好的相關(guān)性，則不需純化，否則需進行純化。由于多數(shù)樣品中都會含有磷酸二酯酶，樣品純化強制酶對cGMP的水解。

血漿（血清）純化

500ul的血漿加上2ml的冰乙醇混勻，室溫下放置5min，1500xg下離心10min以除去沉淀，將上清移至另一10ml的干凈試驗管。在真空離心機中或者氮氣氣流中干燥上清液，然后再加入500μl的EIA緩沖液溶（離心機能用來干燥提取物中的水分），確保所乙醇已經(jīng)除盡以免微量的乙醇影響檢測結(jié)果。

培養(yǎng)基樣品

組織和細胞上清無需純化可直接用于試驗。如果樣品中的cGMP濃度足夠高則需用緩沖液進行10倍的稀釋，試驗操作無需進行任何改動。當樣品低濃度時（樣品無需緩沖液稀釋），稀釋同一培養(yǎng)基中的標準曲線，以達到樣品和標準品基質(zhì)達到相符合。我們建議要首先建立標準曲線以確保在特殊的樣品中試驗也可進行。

細胞液抽提

1. 提出培養(yǎng)基

2. 每35cm²表面區(qū)域加入1ml的0.1M的鹽酸

3. 室溫下孵育20min

4. 用刮刀將細胞從表面刮落

5. 用移液槍吹打混勻直至上清均勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管內(nèi)

6. 1000xg

這些上清可直接用于試驗

組織樣品

7. 組織中的循環(huán)核苷酸會立即分解，所以下離心10min

1. 上清倒入另一干凈試驗管內(nèi)采樣后應將其立即冰凍

2. 冰凍組織稱量，滴加5-10個單位（液體/ml，組織/g）的TCA,用勻漿器將樣品混勻。

3. 1500xg下離心10min，去除沉淀，將上清移至另一干凈試驗管

4. 用水-飽和乙醚從樣品中抽提TCA。5體積的乙醚和1體積的上清，混合10秒，萃取分離，去除上層，重復抽提兩次以上。

5. 通過在70℃下加熱樣品以除去剩余的乙醚。

組織中提取的上清無需稀釋可直接用于試驗，標準曲線基質(zhì)液的準備，抽提10ml 用乙醚處理過的5%的TCA，通過加熱除去剩余的乙醚，剩下的溶液檢測得標準曲線。

特異性試劑的制備

cGMP AChE示蹤液

100dtn cGMP AChE示蹤液與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP AChE示蹤液與30ml的緩沖液

配制的cGMP示蹤液應儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

示蹤染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的示蹤液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示蹤液中或是300ul染料和30ml的示蹤液）

cGMP抗血清

100dtn cGMP抗血清與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP抗血清與30ml的緩沖液

配制的cGMP抗血清應儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

抗血清染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）

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1ml的緩沖液配制cGMP標準品，終濃度為300 pmol/ml，貯存在4℃下，可保存6周。

標準品準備：準備8個干凈試管，標號，吸取900ul緩沖液至1號管，2-8號管加500ul緩沖液，吸取100ul bulk標準品（300 pmol/ml）至1號管，混勻，從1號管吸取500ul至2號管，混勻，依次進行稀釋。稀釋的標準品貯存時間不能超過24h

如圖

樣品的準備：如果樣品需要純化，則根據(jù)純化步驟完成，如無需純化，則無需進一步制備。但是樣品需要稀釋來確保其濃度保持在標準曲線的線性誤差范圍內(nèi)（20%-80%B/Bo）

標準品和樣品的準備----乙酰化

標準曲線的準備

用1mlEIA緩沖液重組標準cGMP，吸取100μl標準A到9.9ml的EIA中，此標準品的濃度是3pmol/ml

注意如果樣品利用組織萃取法提取TCA，且不能用至少1:5的EIA來分析，利用乙醚萃取法提取TCA來準備標準曲線。任何稀釋的樣品需要按此方法進行

用EIA準備標準曲線：取9個干凈試管依次編號#0至#8，吸取900μl到#0（只含有buffer），#2至#8加入500μlEIAbuffer，吸取1ml標準B（3pmol/ml）到#1 ，然后吸取500μl到#2中稀釋，混勻后，從#2中吸取500μl到#3中，混勻，以此類推，至#8，稀釋液保存不能超過24小時