4、貯存與穩(wěn)定性
5、樣品的采集與儲存
| 注意 | 人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時內(nèi)病人應禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。 |
| 注意 | 血液采集后兩小時內(nèi)，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。 | |||
| 注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸的和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應當離心以除去所有的微粒物質。 | ||||
| 貯存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 | |
| 穩(wěn)定性 | 6h | 1個月 | ||
| 可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內(nèi)的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。 | ||
| 貯存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個月 | |
| 數(shù)量 | 標志 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克?。?。 |
| 1×6×2.5ml | CAL A-F | 標準品A-F，即用 腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml （0;8;27;82;273;819nmol/L） 去甲腎上素:0;5;15;50;150;500ng/mL （0;30;89;296;887;2955nmol/L） 多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL （0;78;228;750;2938;14688nmol/L） 內(nèi)含[-]腎上腺素， [-]去甲腎上腺素， [-]多巴胺（有生物活性）, 0.1M的HCl |
| 1×2×2.5ml | CONTROL 1+2 | 質控品1+2 即用,含: [-]腎上腺素，[-]去甲腎上腺素， [-]多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl, 具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽. |
| 1×250μL | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物 濃縮型（100×） 內(nèi)含：堿性磷酸酶標記的抗體，Tris緩沖液， HCl，0.01%的NaN3 |
| 2× | EXTRPLATE | 提取板（微孔板） 每板24孔，包被了硼酸親和凝膠。 |
| 1×60ml | EXTRBUF | 提取緩沖液 粉紅色，即用，內(nèi)含：0.016%的NaN3 |
| 2×1.25ml | COMT LYO | COMT凍干粉 內(nèi)含:兒茶酚-氧位-甲基轉移酶（豬肝），NaN3 |
| 1×2ml | COMT ADD | COMT添加劑 內(nèi)含:人血漿，穩(wěn)定劑，0.01%硫柳汞。 |
| 1×7ml | ANTISERUM DO | 去甲腎上腺素抗血清 紫羅蘭色，即用， 內(nèi)含:抗去甲腎上腺素抗體（兔），緩沖液，穩(wěn)定劑。 |
| 2×1.25ml | COENZ | 酶聯(lián)復合物 即用，內(nèi)含：S-腺苷-L-蛋白酸，穩(wěn)定劑。 |
| 1×3ml | ENZBUF | 酶緩沖液 即用，內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，穩(wěn)定劑。 |
| 1×17ml | RELEASEBUF | Release緩沖液 黃色，即用，內(nèi)含：0.1M的HCl，指示劑。 |
| 1×3ml | ACYLREAG | 酰化試劑 即用，內(nèi)含：二甲基甲酰胺，乙醇。 注意：有毒，高可燃性。 |
| 1×50ml | WASHBUR CONC | 洗滌液 濃縮型（10×） 內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl，吐溫，0.2%的NaN3 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片 內(nèi)含：對硝基苯磷酸（PNPP） |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液 即用，內(nèi)含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液 即用，內(nèi)含：1M的NaOH，0.25M的EDTA |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
1）移液器（10；10-100；100-1000μL）
2）軌道搖床（200-900rpm）
3）旋渦混合器
4）帶儲器的8通道移液器
5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統(tǒng)
6）酶標儀
7）雙蒸水或去離子水
8）吸水紙，取樣吸頭，計時器
| 注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行,下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
| 樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
| 血漿 | 去甲腎上腺素濃度高于zui高標準品中去甲腎上腺素的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
| 尿液 | 去甲腎上腺素濃度高于zui高標準品中去甲腎上腺素的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
| 1） | 將標準品、已稀釋好的質控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。 |
| 2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
| 3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
| 4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。 |
| 5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
| 6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
| 7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。 |
| 8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL?；噭⒓椿旌暇鶆?。 |
| 9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板） |
| 10） | 快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。 |
| 11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
| 12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
| 13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應液，在吸水紙上拍干。 |
| 14） | 每孔加入300μL Release緩沖液。 |
| 15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板） |
| 注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置。 |
| 在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時。 |
| 注意 | 如果要檢測腎上腺素和去甲腎上腺素，我們建議您先檢測腎上腺素。如果使用自動置換型衣液器加樣，請將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加入到提取板的相應微孔內(nèi)，否則剩余的提取液不夠去甲腎上腺素檢測用。將提取板放到有一定坡度的位置上。實驗開始前，確定好腎上腺素和去甲腎上腺素的檢測孔并標記好。 |
| 1 | 在每一微孔內(nèi)加入25ul臨時配制的COMT酶溶液，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
| 2 | 將提取好的標準品、質控品和樣品分別25ul加入到相應的微孔內(nèi)。在此步驟中，我們可以將取樣吸頭直接深入到COMT溶液里。加樣后，溶液顏色變成粉色，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
| 3 | 向每一微孔中加入50ul去甲腎上腺素抗血清（藍色）。 |
| 4 | 蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育120min。 |
| 稀釋 | 成分 | | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩(wěn)定性 |
| 20ml | 洗滌液 | 180ml | 雙蒸水 | 1：10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
| 60μL | 酶聯(lián)物 | 6ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1：101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產(chǎn)生 | 18-25℃ | 30min |
| 4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物緩沖液 | | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 10min |
9） 加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。
| | 尿液 | 血漿 | ||
| μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
| 去甲腎上腺素 | ＜90 | ＜535 | ＜600 | ＜3.55 |
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